Sankt Mariæ Kirke udgør den sydlige fløj af Vor Frue Kloster i Helsingør, som blev stiftet af Erik af Pommern og bygget af Karmeliterordenen omkring 1430 - kort efter Øresundstoldens indførelse. Det firefløjede kloster fra middelalderen er et af de bedst bevarede middelalderklostre i Nordeuropa, selv om de ældste bygninger blev ødelagt af en brand i 1450.
Efter reformationen lå kirken først øde hen, og blev benyttet som rejsestald. Man var lige ved at nedrive den, men da der var mange udlændinge i byen, overlod Frederik 2. den til den tysk-nederlandske menighed. Klosteret blev i 1541 af Christian 3. overladt til et hospital, der ved arv og gaver var en rig stiftelse.
Klosteret blev gennemrenoveret fra 1900-1907 under ledelse af arkitekt H.B. Storck. Kirkens kalkmalerier blev restaureret i 1992.